Kaliforniýa, Stenford uniwersiteti, Stenford uniwersitetiniň lukmançylyk mekdebi Piter Sarnow tarapyndan redaktirlendi, 2020-nji ýylyň 25-nji dekabrynda tassyklandy (2020-nji ýylyň 25-nji oktýabrynda gözden geçirildi)
Köpeltmek we ewolýusiýa gorap saklamak üçin zerur bolan koronawirus-transkripsiýa toplumlaryny köpeltmekde subunitleriň özara täsirini habar berýäris.Nsp12 bilen baglanyşykly NiRAN domeniniň transda nukleozid monofosfat (NMP) geçiriş işjeňliginiň bardygyny subut etdik we nsp9 (RNK baglaýjy belok) nyşany hökmünde kesgitledik.NiRAN, Mn2 + ionlaryna we ýanaşyk konserwirlenen Asn galyndylaryna daýanýan reaksiýada NMP göçüminiň konserwirlenen nsp9 aminokompaniýasyna kovalent birikmesini katalizleýär.NiRAN işjeňliginiň we nsp9 NMPylation koronawirusyň köpelmegi üçin zerurdygy anyklandy.Maglumatlar, öýjükli wirus ferment markeriniň bu işjeňligini, RNK wiruslarynyň bir toparynda RNK sinteziniň başlangyjy funksional we ewolýusiýa taýdan yzygiderli diýen çaklamadaky öňki synlar bilen baglanyşdyrmaga mümkinçilik berýär.
Nidoviralesiň (Coronaviridae, Arterioviridae we beýleki 12 maşgala) RNK-a bagly RNK polimerazasy (RdRps), NiRAN diýlip atlandyrylýan poliproteinden bölünip çykýan strukturasyz belok (nsp) domenine baglydyr. 1ab wirusly esasy proteazdan (Mpro) durýar.Ondan öň, arterial wirus NiRAN-RdRp nsp-nyň öz GMPylation / UMPylation işjeňligi habar berilýärdi we nukleozid monofosfatyň (NMP) (häzirki näbelli) wirusa we / ýa-da öýjük biopolimerizasiýa zatlaryna geçmegi üçin geçiş döretmek teklip edildi.Bu ýerde, koronawirusyň (Adam Coronavirus [HCoV] -229E we agyr ýiti dem alyş sindromy Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2 + garaşly NMPylation işjeňliginiň bardygyny görkezýäris, bu bolsa Mpro-töwellaçylykly nsp9 emele gelmek arkaly nsp9-dan emele gelýär. N-terminaly gapdal nsps proteolitiki taýdan goýberilýär, fosforidat nsp9-nyň N terminalynda esasy amine (N3825) birikdirilýär.Uridin trifosfat bu reaksiýada ileri tutulýan nukleotiddir, ýöne adenozin trifosfat, guanozin trifosfat we sitidin trifosfat hem bilelikde substratlardyr.Rekombinant koronawirus nsp9 we nsp12 beloklaryny we genetiki taýdan döredilen HCoV-229E mutantlaryny ulanyp, mutasiýa barlaglary, NiRAN-töwellaçylykly nsp9 NMPylation we öýjük medeniýetinde wirus köpeltmek üçin zerur galyndylary kesgitledi.Maglumatlar NiRAN işjeň saýt galyndylarynyň çaklamasyny tassyklady we nsp9 N3826 galyndylarynyň nsp9 NMPylation we vitroda wirus köpeltmekdäki möhüm roluny kesgitledi.Bu galyndy, N-terminaly NNE tripeptid yzygiderliliginiň bir bölegi bolup, nsp9-nyň we koronawirus maşgalasyndaky gomologlaryň ýeke-täk üýtgewsiz galyndysydygyny subut etdi.Bu gözleg, beýleki öýjükli wiruslaryň NMPylation işjeňligini funksional öwrenmek üçin berk binýady üpjün edýär we wirusa garşy dermanlary ösdürmek üçin mümkin bolan maksatlary teklip edýär.
Nidowirales polo positiveitel RNK wirusy dürli oňurgaly we oňurgasyz haýwanlary ýokaşdyrýar (1, 2).Buýruk häzirki wagtda 14 maşgalany (3) öz içine alýar, şolardan soňky 20 ýylda Coronavirus maşgalasy giňden öwrenildi.Şol döwürde haýwanlaryň öýlerinden üç sany zoonotik koronawirus ýüze çykyp, adamlarda uly dem alyş ýokançlygynyň döremegine sebäp boldy.Şol sanda agyr ýiti ýokanç keseller sebäpli döreýän pandemiýalar.Dem alyş sindromy Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidowiruslar umumy gen guramasyny paýlaşýarlar we membrana bagly köpeltmek-transkripsiýa toplumynyň (RTC) 5-? Terminalynyň üçden iki böleginde we wirus bölejiginiň esasy gurluş subunitinde, şeýle hem käbir esbaplarda kodlanýar. .Genomyň 3 ?? ² ahyrky böleginde kodlanan belok (1).Meýilnama wiruslarynyň bir maşgalasyndan (Monoviridae) (8) başga, höwürtgelenen wiruslaryň hemmesi genom RNK-den terjime edilen iki sany açyk okalýan çarçuwada (ORF) ORF1a we ORF1b kodlaýar.ORF1a poliprotini (pp) 1a kodlaýar, ORF1a we ORF1b bilelikde pp1ab kodlaýar.ORF1a bilen kodlanan esasy proteazyň (Mpro) umumy gatnaşmagy bilen pp1a we pp1ab ikisi hem proteolitiki taýdan 3CLpro diýlip atlandyrylýan dürli gurluş däl beloklara (nsps) gaýtadan işlenýär, sebäbi pikornawirusyň 3Cpro bilen gomologiýasy bar ( 9).Bu nsps uly dinamiki RTC-e ýygnanyp, genom RNK-nyň sintezini katalizleşdirýär we subgenomiki RNK (transkripsiýa) toplumyny düzýär we ORF1b (10) -yň aşaky akymynda ýerleşýän ORF-yň aňlatmasyny utgaşdyrmak üçin ulanylýar? ? 12).
Esasy RTC, esasan ORF1b-de kodlanan we koronawirus maşgalasynda RNK bagly RNK polimeraza (RdRp) (13), köp maşgalaly 1 helikaza (HEL1) (14, 15) we birnäçe RNK fermentlerini öz içine alýar, bu ýerde nsp12-nsp16 we Arterioviridae maşgalasynda nsp9-nsp12 (10ââ 12 serediň).RdRp we HEL1 guşlaryň höwürtge wirusynyň goralýan iki (bäşden bir) domenini görkezýär we beýleki RNK wiruslarynyň arasynda gomologiýa eýe.Esasy göçürme, beýleki subunitler tarapyndan kömek ediler öýdülýär, pp1a karboksi-terminaly (C terminaly) sebitinden, Mpro-nyň aşaky akymy (coronavirus nsp5 we arterial wirus nsp4).Maşgala aýratyn goragy we dürli çäreleri bar (10â12 salgyda gözden geçirilýär).
Recentlyaňy-ýakynda, ähli öýjükli wiruslarda RdRp bilen ýanaşyk ýerleşýän aminokompaniýada (N-terminus) özboluşly yzygiderlilik häsiýetli bir domen tapyldy, ýöne başga RNK wiruslary ýok (16).Locationerleşýän ýerine we nukleotid geçirişine (nukleozid monofosfat [NMP] transferaz) işjeňligine esaslanyp, bu domene NiRAN (Nestvirus RdRp bilen baglanyşykly nukleotid geçirişi) diýilýär.NiRAN-RdRp goşa domen kombinasiýasy Coronaviridae maşgalasynda nsp12, Arterioviridae maşgalasynda nsp9, beýleki nestoviridae-de NiRAN-RdRp wirusly poliproteinden garaşsyz nsp hökmünde çykarylmagyna garaşylýar.Koronawirusda, NiRAN domeninde 1/450 galyndy bar we birleşdiriji sebit arkaly C terminaly RdRp domenine birikdirilýär (16? 19).Deň arterit wirusynda (EAV) (Arteriviridae), rekombinant nsp9 yzygiderlilikde nestowirusda, AN, BN we CN-de üç sany konserwirlenen yzygiderlilige bagly bolan Mn2 + iona bagly (öz) UMPylasiýa we GMPylasiýa işjeňligini görkezýär.N ýerde NiRAN diýmekdir) (16).Bu motifleriň N-terminaly gyrasy, has az konserwatiw hereket.Bu galyndylaryň käbiri uzakdan baglanyşykly belok kinazlarynda hem saklanýar, bu ýerde nukleozid trifosfat (NTP) baglanyşdyryjy we katalitik işjeňlige gatnaşýandygy görkezildi (20, 21).Bu gözegçilik bilen yzygiderli, Pseudomonas şprisinden SelO pseudokinaza birnäçe esasy işjeň galyndylary ýaňy-ýakynda neşir edilen SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 superkompleks bilen ýygnap bolýar.Konserwasiýa edilen Coronavirus NiRAN galyndylary elektron mikrostrukturasynda ýerleşdirildi.Rekombinant belogy (17).Resminamalaşdyrylan (öz) U / GMPylation, NMP-ni (häzirki näbelli) substrata (16) geçirmek üçin wagtlaýyn ýagdaýy döreder we NiRAN bilen belok kinazynyň (17, 19) arasyndaky gurluş meňzeşligi gipotezadyr? NiRAN beýleki beloklary üýtgedýär.
Öýjükli wiruslar bilen özboluşly we üýtgeşik yzygiderli birleşmegi we RdRp-den genetiki bölünişigi goşmak bilen köp aýratynlyklar, NiRAN-yň döremegi we şahsyýeti üçin möhüm ähmiýete eýe bolan öýjükli wiruslar üçin amatly kadalaşdyryjy fermenti döredýär.Ondan öň gen / subgenomiki terjimesini ýa-da köpeltmek / transkripsiýany kadalaşdyrmak üçin NiRAN bilen baglanyşykly üç mümkin funksiýa diýilýärdi.Şol wagt elýeterli we doly däl maglumatlary göz öňünde tutanyňyzda, her bir funksiýanyň artykmaçlyklary we kemçilikleri bar (16).Bu gözlegde, iki görnüşi aňladýan koronawiruslaryň biohimiki we ters genetiki gözleglerini birleşdirmegi maksat edinýäris we bu syrly äleme düşünmek üçin tapyşlarymyzy koronawirus maşgalasynyň tebigy mutasiýa fonunda goýýarys.NiRAN-a düşünmekde RTC-de tebigy nyşanlary kesgitlemek arkaly gazanylan uly üstünlikleri habar berýäris, bu (bar bolan üç çaklamanyň arasynda), bu domeniň öýjükli wirus RNK sintezini başlatmakdaky roluna goşant goşýar.Bu gözleg, NiRAN-yň wirus kabul ediji interfeýsindäki beýleki rollary üçin mümkinçilikleri açýar.
Korona wirusy nsp12 bilen baglanyşykly NiRAN domeniniň ferment häsiýetlerini häsiýetlendirmek üçin, E. coli-de adam koronawirus 229E (HCoV-229E) nsp12 rekombinant görnüşini öndürdik we C terminalynda His6 belligi bilen birleşdirdik. [α32-P] belok, materiallarda we usullarda beýan edilişi ýaly MnCl2-iň gatnaşmagynda NTP bilen bilelikde inkubasiýa ediň.Reaksiýa önüminiň seljermesi, nsp12 (106 kDa) bilen bilelikde hereket edýän radiolabelli belogyň bardygyny görkezdi, bu koronawirus nsp12-iň, peşew monofosfat (UMP) bilen emele gelen kowalent belok-NMP goşundylarynyň emele gelmegini katalizleşdirýändigini görkezýär (1A surat) we B).San taýdan derňew, beýleki nukleotidler bilen deňeşdirilende, UMP goşulmagynyň signal intensiwliginiň 2-3 esse ýokarlanandygyny görkezdi (1C surat).Bu maglumatlar, koronawirusyň NiRAN domeniniň (16) çak edilýän NMP geçiriş işjeňligine laýyk gelýär, ýöne koronawirusyň NiRAN domeniniň nukleotid islegleriniň we arterial wirusyň başgaçadygyny görkezýär.
HCoV-229E nsp12-iň öz-özüni NMPilasiýa işjeňligi..Reaksiýa önümleri SDS-PAGE bilen bölünip, Coomassie açyk gök reňk bilen boýaldy.(B) Radiolabelirlenen belok fosforly şekillendiriş arkaly şekillendirilýär.Nsp12-His6 we belok molekulýar köpçülik bellikleriniň (kilodaltonlarda) A we B görnüşlerinde görkezilýär (C) Radioaktiw signalyň intensiwligi (ortaça ± SEM) üç sany garaşsyz synagdan kesgitlenildi.* P≤0.05.Signalyň güýji (göterim) UTP bilen baglanyşykly.
NiRAN bilen baglanyşykly ferment işjeňliginiň EAV we SARS-CoV-ni öýjük medeniýetinde köpeltmek üçin möhümdigi görkezilse-de, anyk NiRAN funksiýasy we potensial maksatlar entek kesgitlenmedi.Rakynda NiRAN bilen belok kinazyna meňzeş beloklar maşgalasynyň arasyndaky gurluş meňzeşligi (17, 22), NiRAN-yň beýleki beloklaryň NMPilýasiýasyny katalizleşdirýändigi baradaky çaklamany barlamaga itergi berdi.HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) bilen kodlanan gurluş däl beloklary öz içine alýan potensial birmeňzeş maksatlar toplumyny döretdik, hersinde C terminaly His6 belligi (SI goşundy, S1 tablisa) we bu beloklary nsp12 barlygynda ýa-da ýoklugynda [α32-P] urid trifosfat ([α32-P] UTP) bilen inkubasiýa ediň.E. colide öndürilen iriňli albumin we MBP-LacZα birleşme belogy gözegçilik edipdir (2A surat, 1-7 aralygy).Radiolabelirlenen belok natriý dodekil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) we awtoradiografiýa arkaly seljerildi we nsp12 we nsp9 bolan reaksiýada güýçli radioaktiw signalyň bardygy anyklandy.Signalyň ýagdaýy nsp9-nyň molekulýar massasyna gabat gelýär, bu nsp9-nyň araçylyk UMPilýasiýasyny görkezýär (2B surat, 7-nji surat).Başga synag beloklarynyň UMPylated tapylmady, bu bolsa nsp9-nyň nsp12-iň belli bir substraty diýen netijä gelmegimize sebäp boldy.1-nji suratda görkezilen öz-özüňi NMPilýasiýa maglumatlary bilen yzygiderli, nsp12 dört NMP-ni nsp9-a geçirip bilýär, netijeliligi başga bolsa-da, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> guanozin monofosfat (GMP)> sitidin monofosfat (CMP)) ( Surat).3 A we B).Bu analizde ulanylýan şertlerde (reaksiýany we täsir ediş wagtyny gysgaldyň, nsp12 konsentrasiýasyny azaldyň; materiallar we usullar), nsp12-iň öz-özüni NMPilasiýa tapylmady (2B surat, 7-nji zolak we 1B surat bilen deňeşdiriň). täsirli subut edildi (we birnäçe tapgyr) UMP nsp12-den nsp9-a geçdi.UMP geçiriş işjeňligi, 3C-nji suratda görkezilişi ýaly, Mn2 + ionlarynyň bolmagyny talap edýär, diňe Mg2 + bar bolan ýagdaýynda diňe UMP geçiriş işjeňligi synaldy we beýleki iki bölünen kationyň gatnaşmagynda hiç hili işjeňlik ýokdy.Şuňa meňzeş maglumatlar sitidin trifosfat (CTP), guanozin trifosfat (GTP) we adenozin trifosfat (ATP) (SI goşundy, S1 surat) öz içine alýan NMPylation barlaglarynda alyndy.
HCoV-229E nsp12-nsp9-nyň araçylyk UMPilýasiýasy.HCoV-229E nsp12-His6⁺-medianyň UMPylation işjeňligini bahalandyrmak üçin bir topar belok substratlary (irinli albumin, MBP-lacZα we C terminaly His6 bilen belgilenen HCoV-229E nsps seriýasy) ulanyldy. belok.Beloklary materiallarda we usullarda beýan edilişi ýaly nsp12 ýoklugynda (A) ýa-da ýoklugynda (B) 10 minutlap [α-32P] UTP bilen inkubasiýa ediň.A we B-iň ýokarsynda, Coomassie Brilliant Blue bilen reňklenen SDS-poliakrilamid jeli görkezilýär, A we B aşagynda bolsa degişli awtoradiogramlar görkezilýär.Belok molekulýar köpçülik markeriniň ýagdaýy (kilodaltonlarda) çepde berilýär.Nsp12-His6 (B, ýokarky) ýagdaýy we nsp9-His6 (B, zolak 7) bilen nsp12-His6 inkubasiýa wagtynda görlen radioaktiw signal hem görkezilýär, bu bolsa [α-32P] UMP-den nsp9-His6 Synagdan geçen beýleki beloklar üçin syn edilmedik (12,9 kDa).
HCoV-229E NiRAN, nsp9 NMPylation-yň araçylyk biohimiki we wirus häsiýetnamasy.(A we B) Reaksiýada ulanylýan nukleotid ko-substratynyň roly.Nsp12-His6 we nsp9-His6 adaty NMPylation analizinde dürli [α-32P] NTP-leriň barlygynda garylýar we inkubasiýa edilýär.(A, ýokarky) SDS-PAGE bilen bölünen Coomassie reňkli nsp9-His6.(A, aşaky) Jeliň şol bir meýdanynyň awtoradiografy.(B) Bellenen nukleotid kofaktorynyň barlygynda otnositel işjeňlik (ortaça EM SEM) üç sany garaşsyz synagdan kesgitlenýär.* P≤0.05.(C) metal ionlarynyň roly.[Α-32P] UTP we dürli metal ionlarynyň barlygynda, hersi 1 mM konsentrasiýasy bolan adaty NMPylation synagy görkezilýär.C-de ýokarky, Coomassie reňkli nsp9-His6, C, aşaky böleginde bolsa degişli awtoradiografiýa görkezilýär.Bellenen belogyň ululygy (kilodaltonlarda) A we C-iň çep tarapynda görkezilýär. materiallarda we usullarda.NMPylation reaksiýasynda öndürilen radiolabelli nsp9-His6 fosforilýasiýa şekillendirişi bilen kesgitlenýär (D, ýokarky).Wildabany görnüşli (wt) belok bilen deňeşdirilende işjeňlik D-de görkezilýär we aşagy üç sany garaşsyz synagdan ortaça (± SEM) hökmünde alynýar.Asteriskler goralmadyk galyndylaryň ornuny görkezýär.(E) ýokaşandan 24 sagat soň alnan p1 öýjükleriniň medeni adatdan daşary tebigatyndaky wirus titresi, plak barlagy arkaly kesgitlenildi.In engineenerli HCoV-229E mutantyň NiRAN domenindäki kodon çalyşmalary görkezilýär (galyndy belgileri pp1abdaky ýagdaýyna esaslanýar).Gözegçilik hökmünde RdRp işjeň saýty mutant nsp12_DD4823 / 4AA ulanyldy.
NiRAN-yň işjeň sahypasyna has çuňňur düşünmek we nsp9-a mahsus NMP geçirişiniň işjeňligi bilen baglanyşykly galyndylary kesgitlemek üçin, mutasiýa derňewini geçirdik, NiRAN AN, BN we CN sebäplerinde konserwatiw galyndylary çalşdyk ( 16) Ala (SI goşundy, S2 surat).Mundan başga-da, konserwatiw “Arg-to-Lys” ýa-da “Lys-to-Arg” çalyşmalarynyň täsiri iki ýagdaýda bahalandyryldy.(Negativearamaz) gözegçilik hökmünde, koronawiruslaryň we beýleki öýjükli wiruslaryň NiRAN domeninde saklanmadyk ýa-da az saklanýan galyndylar Ala bilen çalşylýar. K4116A (motif preAN görnüşinde), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif) BN) we D4280A (CN) nsp12 arkaly nsp9 NMPylation-y ep-esli azaldar ýa-da ýok eder, konserwatiw çalyşmalary bolan beloklar (R4178K), K4116R) işjeňliginiň 60% we 80% -ini saklaýar, bu bolsa degişli tarapdaky çäklendirmeleriň gowşandygyny görkezýär. zynjyrlar fiziki-himiki taýdan duýgur (3D surat).Beýleki birnäçe konserwirlenen galyndylary çalyşmak E4145A, D4273A, F4281A we D4283A has az zyýanly we nsp9 UMPylation diňe ortaça azalýar.Şuňa meňzeş netijeler, beýleki NTP-leriň gatnaşmagynda nsp9 NMPilýasiýa reaksiýalarynda (3D we SI goşundy, S3 surat) alyndy, belli bir aminokislotanyň ornuny tutýan täsirleriň ulanylýan nukleotid ko-substratynyň görnüşine bagly däldigini tassyklaýar.Ondan soň, bu nsp12 çalyşmalarynyň öýjük medeniýetinde koronawiruslaryň köpelmegine bolup biljek täsirini synagdan geçirdik.Bu maksat bilen, 5 -7 öýjügi transkripsiýa etmek üçin rekombinant waksina wirusynda (23, 24) klonlaşdyrylan genetiki taýdan döredilen goşmaça DNK (CDNA) şablonlaryny ulandyk.Bu öýjüklerde öndürilen ýokanç wirus nesilleriniň titresi HCoV-229E NiRAN mutantlarynyň köpüsiniň mümkin däldigini görkezdi (3E-nji surat).Wirusly mutantlaryň toparyna witroda (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) ýok etmek ýa-da ep-esli azaltmak üçin görkezilen alternatiwalar bar, ýöne başga iki alternatiwa bar (K4116R, E4145A) 80 % ätiýaçlandyrylanmy?Olaryň in vitro NMPylation işjeňligi goşmaça çäklendirmeleriň bardygyny görkezýär.Şonuň ýaly-da, NiRAN-nyň in vitro NMPylation işjeňliginiň ortaça peselmegine sebäp bolan başga iki mutasiýa (R4178K, F4281A) janly wiruslary döretdi, ýöne bu wiruslar köpeltmek arkaly titrleri ep-esli azaltdy.3D suratda görkezilen in vitro işjeňlik maglumatlary bilen yzygiderli, koronawirusda we / ýa-da beýleki höwürtgeleýän wiruslarda (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) dört sany galyndy çalşyp, nesil janly wiruslary öndürdi. ýabany görnüşli wirus bilen deňeşdirilende ortaça azaldylan titr (3E-nji surat).
NiRAN-töwellaçylykly NMP geçiriş işjeňliginiň işjeň RdRp domenine baglydygyny ýa-da ýokdugyny öwrenmek üçin, RdRp motif C-de bölünen metal ionlaryny (11) utgaşdyrmak bilen baglanyşykly iki sany konserwirlenen Asp galyndysy Ala bilen çalşyryldy. Netijede belok nsp12_DD4823 / 4AA saklanýar. onuň nsp9 NMPylation işjeňligi, vitro nsp9-da nsp12-töwekgelçilikli NMPylation işjeňliginiň polimeraza işjeňligini talap etmeýändigini görkezýär (SI Goşundy, S4 surat).
Nsp12 üçin nsp9-a mahsus NMP geçiriş işjeňligini döredenimizden soň, NMP-nsp9 goşundysyny köpçülik spektrometri (MS) bilen häsiýetlendirmäge synanyşdyk.Rekombinant HCoV-229E nsp9-nyň doly belok massa spektri iň ýokary derejäni 12.045 Da görkezdi (4A surat).Nsp12 goşulmagy, nsp12 we nsp9 ulanylýan şertlerde durnuksyz toplum emele getirmejekdigini görkezýän nsp9 hilini üýtgetmedi (4A surat).UTP we GTP bar bolan ýagdaýynda, nsp9 we nsp12 bolan reaksiýanyň köpçülikleýin ölçegi, UTP-iň belok massasynyň 306 Da, GTP belok massasynyň bolsa 345 Da hereket edendigini görkezdi, bu her nsp9 molekulasynyň UMP ýa-da GMP baglanyşýandygyny görkezýär. (4-nji surat) C we D).NiRAN-töwekgelçilikli nsp9 NMPylation üçin zerur bolan energiýanyň NTP gidrolizinden we pirofosfat goýberilmeginden gelýändigi çaklanylýar.Bu reaksiýada nsp9 (maksat) nsp12 (ferment) -den 10 esse artykmaç ulanylsa-da, nsp9 bilen doly NMPylation diýen ýaly syn edildi, bu nsp12 bilen nsp9 arasyndaky özara täsiriň gysga ömrüni we nsp12 NMPylate has köp nMP9 edip biljekdigini görkezýär. in vitro molekulasy.
Nsp12 we UTP ýa-da GTP bar bolan nsp9-nyň ýekeje NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI goşundy, S1 tablisa) (AD) bölünmedik doly belok massa spektri görkezilýär.(A) diňe nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6, UTP-iň gatnaşmagynda, (D) nsp9 + nsp12-His6, GTP-iň gatnaşmagynda.
Nsp12 bilen UMPylated edilen nsp9 galyndylaryny kesgitlemek üçin, nsp9-UMP tripsin bilen ýapyldy.Alnan peptidler nano-ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa (HPLC) bilen bölünip, tandemiň köpçülik spektrometri (MS / MS) arkaly analiz edildi.Byonik programma üpjünçiligi bukjasyny (Protein Metrics) ulanyp, maglumatlar derňewi N terminaly aminokislotanyň UMPilýasiýasyny görkezdi.Bu el bilen tassyklanýar.Öňünden gelýän peptidiň [UMP] NNEIMPGK (SI goşundy, S5A surat) tandeminiň köpçülik spektri, UMP-iň nsp9-nyň 1 galyndysyna baglydygyny görkezýän bir bölegi 421 m / z-de ýüze çykardy.
Nsp9-nyň N-terminasynda Asn ortokoronawirinanyň agzalarynyň arasynda saklanýar (SI goşundy, S6 surat).N terminaly esasy amin azotynyň UMP üçin iň ähtimal kabul edijidigine ynanýan bolsak-da, N-terminalynda NMP baglanyşygynyň goşmaça subutnamalaryny almagy makul bildik.Şol sebäpli HPLC tarapyndan arassalanan NMPylated we NMPylated N terminaly peptid nsp9 aseton we natriý sianoborohidridiň barlygynda alyndy.Bu şertlerde propil (25) bilen diňe mugt başlangyç aminleri üýtgedip bolýar.NNEIMPGK yzygiderliligi bilen N-terminaly nsp9-dan alnan peptid iki sany esasy amini öz içine alýar, biri Asn-N terminalynda, beýlekisi C terminalyndaky Lys gapdal zynjyrynda.Şonuň üçin propil toparlaryny iki ujunda hem girizip bolýar.NMPilleşdirilmedik peptidleriň çykarylan ion hromatogrammalary SI goşundysynda, S5B suratda görkezilýär.Garaşylyşy ýaly, N-terminal we C terminaly (mono) propilirlenen (SI goşundy, S5B surat, ýokarky zolak) we dipropilirlenen peptidler (SI goşundy, S5B surat, aşaky zolak) kesgitlenip bilner.Bu nagyş, nsp9-nyň NMPylated N-terminal peptidini ulanmak bilen üýtgeýär.Bu ýagdaýda diňe C terminaly propilleşdirilen peptidler kesgitlenip bilner, ýöne N terminaly propilirlenen peptidler we dipropilirlenen peptidler kesgitlenmeýär (SI goşundy, S5C surat), munuň öňüni almak üçin UMP-iň N terminaly esasy amine geçirilendigini görkezýär; üýtgetmekden topar.
Ondan soň, maksatly çäklendirmeleri kesgitlemek üçin nsp9-nyň N-terminusynda saklanan galyndylary çalyşýarys (Ala ýa-da Ser bilen).NiRAN-yň nsp9 galyndysynyň esasy aminasy bilen nsp9-NMP garyndysyny emele getirýändigini görkezýän MS maglumatlarymyza esaslanyp, nsp9 NMPylation nsp9 N-terminalyndan çykarmak üçin wsp master protease (Mpro, nsp5) talap edýär diýip çakladyk. poliprotein prekursory.Bu çaklamany barlamak üçin, E. coli-de nsp9 bolan nsp7-11 deslapky belok öndürdik we [α-32P] UTP (materiallar we usullar) bar bolan adaty NMPylation synagyny etdik.5A suratda görkezilişi ýaly (3-nji zolak), kesilmedik nsp7-11 prekursory nsp12 bilen radiolabelirlenenok.Munuň tersine, nsp9-11 (we beýleki nsps) deslapkydan çykarmak üçin rekombinant nsp5 bilen ýapylan bolsa, nsp9 bilen göçýän radiolabelli belok tapylýar, bu NiRAN we N- kovalent nsp9-NMP goşundylarynyň saýlama emele gelýändigi baradaky netijämizi tassyklaýar. .N-terminaly Asn terminaly başlangyç amin (pp1a / pp1ab-da 3825 pozisiýa).Bu netije, N-terminusda bir ýa-da iki goşmaça galyndy bolan nsp9 konstruksiýasyny ulanmak arkaly geçirilen synaglar bilen hem goldanýar.Iki ýagdaýda-da nsp9-nyň araçylyk eden UMPylation ýatyryldy (SI Goşundy, S7 surat).Ondan soň, nsp9-nyň N terminalynda 3825-NNEIMPK-3832 peptid yzygiderliliginden öçürilen bir ýa-da iki Asn galyndysy bolan belok öndürdik.Iki ýagdaýda-da nsp9 UMPylation doly bloklandy (5B surat), hakyky nsp9 N-termininiň NMP reseptory hökmünde hereket edýändigine goşmaça subutnama berýär.
Nsp9-nyň proteolitiki gaýtadan işlenişi we nsp12-araçylykly UMPylation-da N terminaly galyndylaryň roly.(A) nsp9 UMPylation mugt nsp9 N terminaly talap edýär.Nsp7-11-His6, rekombinant Mpro (nsp5-His6) barlygynda ýa-da ýoklugynda UTP bolan NMPylation kesgitleýiş buferinde 30 ° C-de öňünden inkubasiýa edilýär.3 sagatdan soň, materiallarda we usullarda görkezilişi ýaly nsp12-His6 goşup, NMPylation barlagyny başlaň.Dolandyryş hökmünde nsp5-His6 (1-nji zolak) we nsp9-His6 (2-nji zolak) bolan reaksiýa ulanyldy.10 minutdan soň reaksiýa ýatyryldy we reaksiýa garyndysy SDS-PAGE bilen aýryldy.Belok Coomassie Brilliant Blue (A, ýokarky) bilen boýaldy.Sag tarapda Nsp7-11-His6 prekursory we nsp5-His6 araçylyk bölünişiginiň netijesinde gaýtadan işlenen önüm görkezilýär.Bu jelde nsp7 we nsp11-His6-yň ýüze çykyp bilmejekdigine üns beriň (reaksiýa nsp5-His6 (1 we 4 zolaklar; nsp5-His6 ýagdaýy berk tegelek bilen görkezilýär)) ýa-da nsp9-His6 (2-nji zolak) galyndy hapalar hökmünde az mukdarda MBP (açyk tegelekler bilen görkezilýär) öz içine alýar, sebäbi olar MBP birleşme beloklary hökmünde görkezilýär (SI goşundy, S1 Tablisa)..“Coomassie” bilen reňklenen B, SDS-PAGE ýokarda, B, aşaky böleginde degişli awtoradiograf görkezilýär.Molekulýar agram belliginiň ýagdaýy (kilodaltonlarda) çepde görkezilýär.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N terminaly konserwirlenen galyndylar Ala ýa-da Ser bilen çalşyryldy we nsp12-His6 araçylyk UMPylation reaksiýasynda şol bir mukdarda belok ulanyldy.Reaksiýa önümleri SDS-PAGE bilen bölünip, Coomassie Brilliant Blue (C, ýokarky) bilen boýaldy we radiolabelli nsp9-His6 fosforesensiýa şekillendiriş arkaly tapyldy (C, orta).Wildabany görnüşli (wt) belogy salgylanma hökmünde ulanyp (100% -e deňdir), degişlilikde NMPylation işjeňligi (ortaça EM SEM) üç sany garaşsyz synagdan hasaplandy..Negativearamaz gözegçilik hökmünde köpeltmek ýetmezçiligi bolan RdRp motif C goşa mutant DD4823 / 4AA ulanyldy.
Nsp9-nyň N terminaly (esasanam 1, 2, 3 we 6-njy pozisiýalar) Ortokoronawirinae kiçi maşgalasynyň agzalarynyň arasynda gaty saklanýar (SI goşundy, S6 surat).Bu galyndylaryň nsp12-araçylykly nsp9 NMPylation-da bolup biläýjek roluny öwrenmek üçin, nsp9-nyň N-terminasynda yzly-yzyna iki sany Asn galyndysy Ala ýa-da Ser (ýeke ýa-da bilelikde) bilen çalşyryldy.Wildabany görnüşli nsp9 bilen deňeşdirilende, N3825-ni Ala ýa-da Ser bilen çalyşmak, nsp12-araçylykly UMPylation-yň iki esse azalmagyna getirdi (5C-nji surat).NMPilýasiýa N terminaly galyndylaryň gapdal zynjyrynyň ýerine N terminaly başlangyç aminde ýüze çykýar diýen netijä gelmek bilen, N3825A we N3825S çalyşmagy bilen ep-esli galyndy NMPilýasiýa syn etdik.Gyzykly tarapy, ikinji Asn Ala ýa-da Ser bilen çalşylsa, nsp9 UMPylation has güýçli azalýar (10 esse köp), Ala-nyň 3, 4 we 6-njy pozisiýalarda çalşylmagy diňe nsp9 UMPylation-a ortaça täsir edýär (2-nji surat) ).5C).Şuňa meňzeş netijeler ATP, CTP ýa-da GTP (SI goşundy, S8 surat) ulanylyp alyndy.Köpçülikleýin ýagdaýda bu maglumatlar N289 NMPylation-da N2826-nyň (nsp9-daky 2-nji orny) esasy roluny görkezýär.
Nsp9 N-terminasy bilen NMPylation-yň arasyndaky funksional arabaglanyşygyň goşmaça subutnamalaryny almak üçin, Coronavirus maşgalasynyň nsp9 yzygiderliliginiň köp yzygiderliligini (MSA) ýerine ýetirdik (104 bilen 113 galyndy arasynda üýtgeýär) (SI Goşundy, Surat S6).Umuman alanyňda, dürli süýdemdirijileri, guşlary we süýrenijiler öýjügini ýokaşdyrýan “Ortokoronawirinae” subfamilyasynyň 5 görnüşiniň 47 (belli we goýulýan) görnüşinde jemi 8 galyndy üýtgemedi.Öçürmek we goýmak ýaly iň giň üýtgeşmeler, öňki gurluş gözlegleri (26 ?? 28) tarapyndan kesgitlenişi ýaly nsp9-nyň ikinji gurluş elementleriniň arasyndaky sikllerde syn edildi.Nsp9-nyň C terminaly böleginiň β setirinde we α gelixinde bäş sany üýtgeşik galyndy tapyldy.Üç sany üýtgemeýän galyndy, nsp9 N terminalynyň NNE motifini emele getirýär.Bu motifiň ikinji Asn-yň uzakdaky gurbaga koronawirusynyň gipotetiki nsp9 bilen paýlaşylýan we Alfaletowirusyň Letowirinae maşgalasynda Microhyla letovirus 1 görnüşini aňladýan ýeke-täk üýtgewsiz galyndydygy mälim edildi.Nsp9 ikinji derejeli gurluş elementlerinde galyndylaryň saklanmagy, eplenýän ýa-da belli RNK baglanyşyk häsiýetlerini saklamak üçin gurluş pikirleri bilen rasionallaşdyrylyp bilner.Şeýle-de bolsa, bu pikir NNE-ni gorap saklamak üçin ulanylmaýar we bu gözlegden öň tripeptid yzygiderliliginiň üýtgemegini çäklendirýän çäklendirmeleriň tebigaty düýbünden gizlenipdi.
Koronawirusyň köpelmeginde nsp9-NMPylation we NNE gorap saklamagyň ähmiýetini kesgitlemek üçin, nsp9 NMPylationyň vitro-da zyýanlydygyny görkezýän HCP-229E mutant öndürdik.Başlamazdan ozal, bu çalyşmalar (nsp8 | 9 ýaryş meýdançasynyň golaýynda) C terminaly pp1a sebitiniň proteolitiki gaýtadan işlenişine täsir edýärmi diýen soraga jogap bermäge synanyşýarys.E. coli-de nsp9-nyň N-terminasynda degişli çalyşmalary öz içine alýan nsp7-11 poliprotein konstruksiýalary toplumy öndürildi we rekombinant Mpro bilen kesildi.Dört meýdançanyň proteolitiki bölünişi (nsp9 gapdalyndaky sahypany hem goşmak bilen), Mpro-mediasy nsp8 | 9 ýarylmagyna päsgel berýän bu beloklaryň gurluş üýtgemelerini hasaba almazdan, girizilen çalyşmalara (SI goşundy, S9 surat) ep-esli täsir etmeýär. web sahypasy.
Huh-7 öýjükleri, nsp9 N terminalynda konserwirlenen NNE tripeptidlerinde (N3825, N3826 we E3827) Ala ýa-da Ser çalyşmalaryny kodlap, gen uzynlygyndaky HCoV-229E RNA bilen ýokaşdy, bu mutasiýalaryň köpüsiniň ölümlidigini görkezýär.N-terminaly Asn (N2835A ýa-da N2835S) Ser ýa-da Ala çalyşmak arkaly wirusy halas edip bildik, ýöne NNE yzygiderliliginde (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, beýleki ýeke we goşa mutasiýa bilen wirusy dikeldip bilmedik). NN3825 / 6SS), E3827A) (5D-nji surat).
Bu netijeler, koronawiruslaryň dokuma medeniýetinde köpeldilmeginiň çäklendirilendigini (şol bir ýa-da şuňa meňzeş), bedende nsp9 NMPylation ýerleriniň tebigy üýtgemegini çäklendirýändigini we koronawiruslaryň ýaşaýyş siklinde bu jogabyň esasy roluny goldaýandygyny görkezýär.
Synaglaryň soňky toplumynda SARS-CoV-2 nsp12 we nsp9 belgili His6 terminaly we E. coli-de nsp12-iň iki mutant görnüşini öndürdik.NiRAN we RdRp domenlerindäki işjeň sahypa galyndylary degişlilikde Ala ulanyň (6A surat we SI goşundy, S2 tablisa).SARS-CoV-2 nsp12-de K4465, NiRAN işjeňligi we HCoV-229E köpeltmek üçin zerurdygyny subut eden HCoV-229E (SI goşundy, S2 surat) K4135 gabat gelýär (3D we E surat).Bu galyndy, öň NiRAN öz-özüni UMPylation / öz-özüni GMPylasiýa etmek üçin zerurdygy görkezilen arterial wirus EAV nsp9 K94 galyndysyna-da gabat gelýär.6B suratda görkezilişi ýaly, SARS-CoV-2 nsp12 nsp9-ny substrat hökmünde ulanyp, UMP geçiriş işjeňligine eýe, nsp12_K4465A işjeň saýt mutanty hereketsiz.RdRp motif C-iň SDD häsiýetli yzygiderliliginde goşa çalyşmak UMP geçiriş işjeňligine täsir etmeýär (6B surat), bu RdRp işjeňliginiň nsp9 UMPylation-da göni täsiriniň ýokdugyny görkezýär.Şuňa meňzeş maglumatlar CTP, GTP we ATP (SI goşundy, S10 surat) ulanylyp alyndy.Gysgaça aýtsak, bu maglumatlar NiRAN-töwellaçylykly nsp9 NMPylation, ortokoronawirus subfamilyasynyň dürli görnüşlerini görkezýän koronawiruslarda konserwatiw işjeňligiň bardygyny görkezýär.
SARS-CoV-2 nsp12-nsp9-nyň araçylyk NMPylation.(A) Coomassie, NMPylation synagynda ulanylýan rekombinant belogyny görkezýän SDS-poliakrilamid jeli.Dolandyryş hökmünde, SARS-CoV-2 nsp12-iň NiRAN domeninde (K4465A) we RdRp domeninde (DD5152 / 3AA) işjeň saýt çalşygy bolan mutant belok ulanyldy.Galyndy belgileri pp1ab-daky pozisiýa esaslanýar.(B) nsp9-His6 we [α-32P] UTP nsp12-His6 (ýabany görnüş [wt] we mutant) substraty hökmünde UMPylation kesgitlemesiniň awtoradiografy.Bellenen belogyň molekulýar massasy (kilodaltonlarda) çepde görkezilýär.
NiRAN domenleri, adatça, Nidowiralesde (16) saklanýar, bu bolsa Nidowirusyň köpelmegi üçin zerur ferment reaksiýalaryny katalizleýär.Bu gözlegde, koronawirusyň NiRAN domeniniň tebigy maksat hökmünde kesgitlenmegi üçin NMP (NTP-den emele gelen) nsp9-a, wirusyň köpelmegine gatnaşýan syrly RNK baglaýjy belogy nsp9-a geçirýändigini subut edip bildik. koronawirus RTC-iň hyzmatdaşy.
NiRAN domeni monofiletiki, ýöne ýokary derejede tapawutlandyrylan Nidovirales tertibinde (8, 16) az sanly galyndylary öz içine alýan üç yzygiderlilik motiwini (AN, BN we CN) paýlaşýar.Soňky gözlegler, esasan SelO maşgalasy diýlip atlandyrylýan (17, 19, 22, 30, 31) belok kinaz ýaly beloklaryň esasan häsiýetlendirilmedik maşgalasy bilen baglanyşyklydygyny görkezdi.SelO bilen baglanyşykly beloklaryň kinase bukjalary bar, ýöne klassiki kinazlarda birnäçe konserwirlenen işjeň saýt galyndylary ýok (22, 32).Işjeň saýta baglanan we belli bir täsirleşmeler arkaly durnuklaşdyrylan ATP molekulalarynyň ters ugruna esaslanyp, SelO gipotezalaşdyryldy we soňra AMP (fosfatyň ýerine) belok substratyna (22), SelO meňzeş başga bir bakteriýa YdiU-da geçirilendigi tassyklandy. ýaňy-ýakynda UMP-nyň Tyr we onuň dürli belok substratlarynyň galyndylaryny katalizleşdirmegi görkezildi (33).
Koronawirus NiRAN domeniniň işjeň işjeň galyndylarynyň çaklamasyny tassyklamak we giňeltmek üçin koronawirus nsp12-de mutasiýa derňewini geçirmek üçin biohimiki we ters genetika usullaryny ulandyk (3D surat we E we SI goşundy, S3 surat we tablisa) S1â S4).Maglumatlar HCoV-229E K4135, R4178 we D4280-iň Ala bilen çalşylmagynyň vitro NMP geçiriş işjeňligini we öýjük medeniýetinde wirusyň köpelmegini ýok edýändigini görkezýär (3D we E we SI goşundylary, S3 surat), olaryň NTP γ-fosfatda bolmagyny goldaýar. (K4135, R4178) we işjeň ýer metal ionlarynyň utgaşdyrylmagy (D4280).K4135 (17) ýagdaýyny durnuklaşdyrjak çaklanylýan guş höwürtgesiniň diapazonyndaky konserwirlenen Glunyň E4145A çalyşmagy wirusyň köpelmegini ýok etmek üçin görkezildi, ýöne geň galdyryjy zat, in vitro NMPylation analizinde (3D we E surat we SI goşundy, S3 surat we S1 - S4 tablisalar).Salmonella tifimuriumyň (E130A) (33) YdiU gomologynda degişli çalyşma girizilende şuňa meňzeş gözegçilik edildi.Bu maglumatlar bilelikde alynsa, katalitik funksiýa däl-de, bu konserwirlenen galyndylaryň kadalaşdyryjy funksiýasyny goldaýar.
HCoV-229E NiRAN domeninde (8) konserwlenen Phe galyndysyny (F4281A) çalyşmak, vitroda NMPylation işjeňliginiň peselmegine we öýjük medeniýetinde wirusyň köpelmeginiň ep-esli azalmagyna getirdi (3D, E we SI surat) goşundy, S3 surat).Maglumatlar bu galyndynyň ozal görkezilen birmeňzeş DFG motif Phe galyndysy ýaly möhüm kadalaşdyryjy funksiýasyna laýyk gelýär.Klassiki belok kinazlarynda, Mg2 + baglaýjy aýlawyň bir bölegi bolup, oňurgany ýygnamaga we sazlamaga kömek edýärmi???Netijeli katalitiki işjeňlik üçin zerur (32, 34).Ala we Arg-ny K4116 galyndylary bilen çalyşmak (preAN motifinde) wirusyň köpelmegini aradan aýyrdy we garaşylşy ýaly, aminokislotanyň gapdal zynjyryna baglylykda vitroda NMP geçiş işjeňligine dürli täsir etdi (3D we E we SI goşundylary) , S3 surat).Funksiýa maglumatlary, bu galyndy ATP fosfat bilen täsirleşendigini görkezýän gurluş maglumatlary bilen gabat gelýär (17).Beýleki höwürtgeleýän wirus maşgalalarynyň NiRAN domeninde HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 Lys, Arg ýa-da His (8) eýeleýär, bu aýratyn galyndynyň funksional çäklendirmesiniň gowşadylandygyny görkezýär.D4188A we D4283A çalyşmagy fermentleriň işjeňligini ýok edýär ýa-da güýçlendirýär we wirusyň köpelmegini ýok edýär (3-nji surat).Bu iki galyndy, maşgala mahsus, ýöne katalitik däl funksiýany görkezýän öýjükli wiruslaryň köpüsinde (8) saklanýar.Dolandyryş hökmünde Coronaviridae ýa-da beýleki Nestioviridae maşgalalarynda (8) goralmaýan başga-da birnäçe Lys we Asp galyndylarynyň (K4113A, D4180A, D4197A we D4273A) çalyşmalary ulanyldy.Garaşylyşy ýaly, fermentleriň işjeňliginiň birneme peselmegi we käbir ýagdaýlarda wirusyň köpelmegi bilen bu çalyşmalar esasan çydamlydyr (3-nji surat we SI goşundy, S3 surat).Umuman aýdanyňda, koronawirus mutagenez maglumatlary EAV NiRAN-RdRp (16) öz-özüni GMP we ters genetika maglumatlary bilen örän laýyk gelýär, onda EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortolog) K94 galyndysy (HCoV- 229E K4135) möhüm funksiýalara laýyk gelýär), R124 (R4178 gabat gelýär), D132 (D4188 gabat gelýär), D165 (D4280 gabat gelýär), F166 (F4281 gabat gelýär).Mundan başga-da, HCoV-229E mutagenez maglumatlary, öň habar berlen SARS-CoV ters genetika maglumatlaryna (16) laýyk gelýär we giňeldilýär, edil degişli CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The beýan edilen fenotip -F219A we HCoV-229E_F4281A (3-nji surat D we E we SI goşundy, S3 surat we S1-S4 tablisa).
UTP we GTP (öz-özüni NMPylasiýa reaksiýasynda) aç-açan ileri tutýan EAV ortologlary (16) bilen deňeşdirilende, gözlegimiz koronawirus NiRAN domeniniň (HCoV-229E we SARS-CoV-2 bilen görkezilýär) täsirli bolup biljekdigini görkezýär. UMP üçin birneme artykmaçlyk bar bolsa-da, dört NMP-iň hemmesini geçirdi (1-nji we 3-nji suratlar).Specificörite NTP bilelikdäki substratyň has pes aýratynlygy, ýaňy-ýakynda habar berlen SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 superkompozit gurluşyna laýyk gelýär, onda ADP-Mg2 + NiRAN-yň işjeň saýty bilen baglanyşýar, ýöne adenin bölegi bilen däl aýratyn täsirleşmeleriň emele gelmegi (17).Biziň gözlegimizde, NMPylation reaksiýasynda ulanylýan nukleotidiň görnüşi, mutant belogynyň işjeňligine hiç hili diferensial täsir etmeýär (SI goşundy, S3 surat), bu galyndylaryň hiç biriniň belli bir nukleobazanyň baglanyşygy bilen ýakyn baglanyşykly däldigini görkezýär.Koronawiruslaryň we arterial wiruslaryň NiRAN domenlerinde syn edilýän dürli NTP bilelikdäki substrat ileri tutmalarynyň gurluş esaslary we potensial biologiki ähmiýeti öwrenilmeli;dogry bolup biler ýa-da degişli okuwlarynyň çäkliligi sebäpli bolup biler.Häzirki wagtda arterial wirus NiRAN domeniniň potensial NMPylator işjeňliginiň (ozal häsiýetlendirilen NMPylation işjeňligi bilen deňeşdirilende) arterial we koronawirusyň meňzeşligini göz öňünde tutup, başga bir substrat ileri tutýandygyny inkär edip bolmaz. NiRAN domeni öz çäginde.Yzygiderlilige esaslanýan deňeşdirme (16).Mg2 + -ni kofaktor hökmünde ulanýan SelO pseudokinaza bilen deňeşdirilende, koronawirus we arterial wirus NiRAN-yň işjeňligi Mn2 + (16) baglydyr (3C surat we SI goşundy, S1 surat).UTP üçin Mn2 + garaşlylygy we aç-açan ileri tutulmagy, NMPylator belogynyň üýtgeşik bir aýratynlygy bolup, öýjükleri stres induksiýasyndan goramak üçin berk Mn2 + garaşly belok çaperon UMPylation katalizleýän Salmonella tifimuriumyň YdiU belogynda tassyklandy. 33).
Recentlyakynda koronawirus NiRAN domeni bilen öýjükli belok kinazlarynyň (17, 19) arasyndaky gurluş meňzeşligi NiRAN-yň NMP-ni bu işde habar beren beýleki beloklarymyz bilen oňat baglanyşdyrmak ukybyna goşmaça goldaw berýär.Gözlegimizi, RTC-iň ORF1b kodlanan göçürmesine gönüden-göni ýa-da gytaklaýyn kömek berýän HCoV-229E ORF1a kodlanan beloklara gönükdirdik (12, 35).Synaglarymyz, nsp9-yň täsirli we anyk NMPylation üçin anyk subutnama berýär (2-nji surat).Maksatly belok, fermentden (nsp12) 8-10 esse ýokary bolan köp mukdarda ulanylsa, nsp9-nyň doly (mono) NMPizeddigi tassyklanýar (4-nji surat).Nsp12 bilen nsp9 arasyndaky özara täsiriň gysga möhletli we nsp9 bilen durnukly toplum emele getirmejekdigi barada netijä geldik (beýleki RTC bölümleri ýok bolsa).Bu netije, SARS-CoV proteome (35) boýunça beloklaryň özara täsirleri bilen goldanýar.MS derňewi, Nsp9-nyň N terminaly galyndysynyň esasy aminini NMPylation saýty hökmünde kesgitledi (SI goşundy, S5 surat).Fosforamidat baglanyşygynyň we N terminaly amin toparynyň emele gelmegi, NiRAN-töwellaçylykly NMPylation işjeňligini Pseudomonas şpris SelO-ara AMPylation reaksiýasyndan tapawutlandyrýar, bu Ser, Thr ýa-da Tyr galyndylarynda O-bagly AMP-iň emele gelmegini katalizleýär. 22), we S. typhimurium YdiU O bilen baglanyşykly (Tyr bilen) we N bilen baglanyşykly (Onuň bilen) peptid-UMP goşundylaryny emele getirýär.SelO beloklar maşgalasynda bar bolan çäkli maglumatlar, bu uly belok maşgalasynyň agzalarynyň peptid-NMP garyndylarynyň emele gelmeginde düýpgöter tapawutlanýandygyny görkezýär.Bu, has giňişleýin öwrenilmäge mynasyp gyzykly syn.
Bu gözlegde alnan maglumatlar, nsp9-nyň NMPylation-yň mugt N-terminus talap edýändigini çaklamaga sebäp boldy.Wirus köpeltmek kontekstinde, bu Mpro we pp1ab tarapyndan araçylyk edilen poliprotein pp1a köpeltmekde nsp8 | nsp9 gaýtadan işleýän ýeriň proteolitiki bölünişi bilen üpjün ediler.Koronawiruslaryň köpüsinde bu aýratyn saýtyň (VKLQ | HCoV-229E-de NNEI) we beýleki koronawirus Mpro bölüniş ýerleriniň arasyndaky tapawut Asn (Ala, Ser ýa-da Gly ýaly başga bir kiçijik galyndy däl) P1â eýeleýärmi???Locationerleşýän ýeri (36)Irki gözleglerde alnan peptidiň döwülmegi maglumatlary, nsp8 | nsp9 saýtynyň bölüniş netijeliliginiň beýleki saýtlara garanyňda pesdigini görkezdi, bu 1) bu ýörite sahypanyň C terminalynyň öz wagtynda utgaşdyrylmagynda kadalaşdyryjy rol oýnap biljekdigini görkezýär. pp1a sebiti, ýa-da 2) a wirusyň köpelmeginde ýörite goralýan nsp9 N-termininiň roly (37).Maglumatlarymyz (5A surat) hakyky N terminaly yzygiderliligini göterýän nsp9-nyň rekombinant görnüşiniň nsp12 tarapyndan täsirli NMPizasiýa edilendigini görkezdi.N terminalyň gapdal yzygiderliligi Xa faktor (nsp9-His6; SI goşundy, S1 tablisa) ýa-da Mpro-ara aralyk (nsp7-11-His6; 5A surat we SI goşundy, S1 tablisa) bilen aýryldy.Möhümi, nsp9 öz içine alýan deslapky nsp7-11-His6, nsp9-NMP goşundysynyň N terminaly esasy aminiň üsti bilen emele gelendigini görkezýän nsp12-iň NMPylation-a garşylyk görkezdi. .NiRAN substrat aýratynlygyna has çuňňur düşünmek üçin, nsp9-nyň ýanaşyk N terminaly galyndylaryna ünsi jemledik.Beýleki beloklar ýok bolsa, gurluş taýdan çeýe bolup, olaryň nsp9 (26 28, 38) belgilenmedik görnüşinde ýüze çykmagynyň öňüni alýar, çäkli tebigy üýtgemelerini görkezýär Bu möhüm yzygiderlilige bagly (ikinji derejeli gurluş bilen baglanyşykly däl) nsp9 N terminaly bölek.Bu sebitdäki konserwirlenen galyndylaryň çalyşmalary (5C we D we SI goşundy, S8 surat) vitroda nsp9 NMPylation üçin N3826-nyň zerurdygyny görkezýär, N3825A we E3827A çalyşmalary NMPylation-yň azalmagyna sebäp bolýar, M3829A we P3830A çalyşmalary bolsa. .Elbetde, nsp9 NMPylation-a täsir edýär.N terminaly Asn (N3825A, N3825S) çalyşmagy diňe nsp9 NMPilýasiýa we öýjük medeniýetinde wirusyň köpelmegine ortaça täsir etse-de (5C we D surat), N terminaly 3825-NN dipeptidinden Asn galyndy yzygiderliliginiň ýok edilmegi wiruslar üçin öldüriji bolup, N-terminusda bir Asn galyndysynyň, has gowusy Asn-dan talap edilýändigini görkezýär, ýöne şuňa meňzeş galyndylaryň çalşylmagyna bölekleýin ýol berilýän ýaly görünýär (5B, C we D surat).3825-NN dipeptidiň, esasanam koronawirus aralygyndaky konserwirlenen we zerur N3826 galyndysynyň (SI goşundy, S6 surat) NiRAN-yň işjeň ýerinde nsp9 N-terminusyň dogry baglanyşygyny we ugruny üpjün edýär diýen netijä gelýäris.
Alahli kiçi maşgalalaryň konserwirlenen Glu üçin Ala (E3827A) çalyşmagy vitro-da nsp9 NMPylation saklaýar, ýöne öýjük medeniýetindäki wiruslar üçin öldüriji (5C we D surat), bu galyndynyň goşmaça funksiýasyny görkezýär, mysal üçin, esasy täsirlerde (NMPylated ýa-da kodlanmadyk) ) nsp9 N-terminus we wirusy köpeltmek bilen baglanyşykly beýleki faktorlar.Nsp9 mutasiýa, nsp9 proteolitiki prosesine ýa-da oňa ýanaşyk nsps (39) (SI goşundy, S9 surat) täsir etmedi, syn edilen birnäçe nsp9 mutasiýa ölüm howply fenotipleriniň C proteolitiki proses terminaly pp1a sebitiniň tertipsizligi sebäpli ýüze çykmandygyny görkezýär; .
Aboveokardaky maglumatlar, pp1a / pp1ab-da nsp8 | 9 bölünen ýeriň Mpro-araçylyk bejergisinden soň, nsp9-nyň N terminaly UMPylated (ýa-da başga bir NMP bilen bölekleýin üýtgedilip bilinjekdigini) subut edýär.Mundan başga-da, nsp9-nyň N-termininiň ajaýyp goralyp saklanmagy (koronawirus maşgalasyndaky ýeke-täk we üýtgemeýän Asn galyndylaryny goşmak bilen) we bu işde alnan ters genetika maglumatlary (3E we 5D suratlar) beýan edilen nsp9 NMPylation barada netijä gelmegimize sebäp boldy. biologiki taýdan baglanyşykly we koronawirusyň köpelmegi üçin zerurdyr.Bu üýtgetmäniň funksional netijeleri, mysal üçin, öň beýan edilen (anyk däl) nsp9 (kodlanmadyk görnüş) RNK baglanyşyk işi (2628) bilen baglanyşykly öwrenilmeli.N terminaly NMPylation, nsp9-nyň belok ýa-da RNK substratlary bilen täsirine ýa-da dürli dört derejeli ýygnaklaryň döremegine täsir edip biler.Bular gurluş gözleglerinde syn edildi we koronawirusyň köpelmegi bilen iş ýüzünde baglanyşyklydygy tassyklandy, esasanam bu üýtgetme bolmadyk ýagdaýynda (26- ââ29, 40).
Koronawirus NiRAN domeniniň maksatly aýratynlygy henizem has jikme-jik häsiýetlendirilmeli bolsa-da, maglumatlarymyz koronawirus NiRAN domeniniň belok maksatly aýratynlygynyň gaty dardygyny görkezýär.Idhli nidowirus maşgalalarynyň NiRAN domeninde esasy işjeň ýer galyndylarynyň (8, 16) goralyp saklanmagy, bu beloklaryň konserwirlenen NMPylatorynyň işjeňligini güýçli goldaýan bolsa-da, bu domeniň jübüsiniň galyndylaryny baglanyşdyrmak we goramak we Nidovirales maksatly dürli maşgalalaryň arasynda tapawutlanyp biler.Şonuň ýaly-da, beýleki höwürtgeleýän wiruslaryň degişli nyşanlary entek kesgitlenmeli däl.Olar nsp9 ýa-da beýleki beloklaryň uzakdaky ortologlary bolup bilerler, sebäbi höwürtgeleýän wiruslarda saklanylýan bäş sany köpeltmek domeniniň daşyndaky yzygiderlilik az saklanýar (8), şol sanda Mpro bilen NiRAN arasyndaky gen massiwini, olaryň arasynda nsp9 ýerleşýär koronawirus.
Mundan başga-da, häzirki wagtda NiRAN domeniniň goşmaça (öýjükli hem) nyşanlarynyň bolmagy mümkinçiligini aradan aýyryp bilmeris.Bu ýagdaýda ýüze çykýan belok NMPylatorlarda (NMPylators) (30, 31) bakterial gomologlaryň “ussat sazlaýjylary” bar ýalydygyny bellemelidirismi?NMP, aşaky akymlaryny kadalaşdyrmak ýa-da ýok etmek üçin dürli öýjükli beloklary modulirleýär we şeýlelik bilen öýjükli stres täsiri we redoks gomeostazy ýaly dürli biologiki proseslerde rol oýnaýar (22, 33).
Bu gözlegde (2-nji we 4-nji suratlar we SI goşundy, S3 we S5 suratlar), nsp12-iň UMP (NMP) bölegini nsp9-da ýekeje (konserwirlenen) ýagdaýa geçirendigini subut edip bildik, beýleki beloklar bolsa üýtgedilmedi ulanylýar Şertlerde gowy kesgitlenen (gowşak däl) substrat aýratynlygy goldaýar.Munuň bilen yzygiderli, N-terminaly nsp9 NMPylation bilen deňeşdirilende, nsp12-iň öz NMPylation işjeňligi gaty pes, ýüze çykarylmagy awtoradiografiýa täsiriniň has köp wagtyny talap edýär we nsp12 konsentrasiýasynyň 10 esse ýokarlanmagy ulanylýar.Mundan başga-da, MS analizimiz, NiRAN domeniniň öz-özüni NMPylation (iň gowusy) ikinji derejeli işdigini görkezýän nsp12 NMPylation üçin subutnama berip bilmedi.Şeýle-de bolsa, beýleki gözlegleriň, bakterial NMPylatoryň öz-özünden AMPilasiýa ýagdaýynyň beýleki belok substratlarynda NMPylation işjeňligini dolandyryp biljekdigini deslapky subutnamalar bilen üpjün edendigini bellemelidiris (22, 33).Şol sebäpli, EAV nsp9 (16) we coronavirus nsp12 (bu gözleg) üçin habar berlen öz-özüňi NMPylation işleriniň bolup biläýjek funksional täsirlerini, şol sanda C terminaly RdRp domeniniň bukulmagyna teklip edilýän çaperona meňzeş täsirini öwrenmek üçin has köp gözleg gerek. 16)).
Mundan ozal, nidowiral NiRAN domeniniň aşaky akym funksiýalary bilen baglanyşykly birnäçe çaklamalar göz öňünde tutulypdy, şol sanda RNK ligasy, RNK bilen örtülen guanlat geçirişi we belok başlangyç işjeňligi (16), ýöne olaryň hiç biri-de bar bolan aşaky funksiýalara laýyk gelmeýär.Aşakdaky wezipelerde alnan maglumatlar goşmaça çaklamalar etmezden edil şol bir wagtyň özünde.Bu gözlegde alnan maglumatlar, NiRAN domeniniň belok bilen örtülen RNK sinteziniň başlangyjyna iň laýyk gelýär (ýöne subut edip bilmeýär).Öň 5-de NiRAN domeniniň funksiýasyna ynanýardylarmy ??²-RNA ýapmak ýa-da RNK baglanyşyk reaksiýalary bulara we beýleki maglumatlaryň goldawyna täsir etmeýär.Şonuň üçin, mysal üçin, NiRAN-yň işjeň saýty, umumy bazany gorap saklan Asp-a degişlidir (Pseudomonas syringae SelO-da D252; HCoV-229E pp1ab-da D4271; SARS-CoV-2 nsp12-de D208) (SI Goşundy, 2-nji surat) ).S2) (17. 41).Mundan başga-da, konserwirlenen belok nyşanlary üçin koronawirus NiRAN-yň ajaýyp yzygiderliligi we NTP bilelikdäki substratlar üçin rahatlyk aýratynlygy NiRAN-töwekgelçilikli ýapyş fermentine ýa-da RNA ligase meňzeş funksiýalara garşy.
Elbetde, öň habar berlen birnäçe gyzykly, ýöne (şu wagta çenli) habarlary birleşdirjek belok bilen örtülen RNK sintezinde nsp9-UMP (nsp9-NMP) bolup biläýjek roly barlamak we subut edilse, köp goşmaça iş gerek. .Izolýasiýa synlary.Mysal üçin, koronawirusyň otrisatel RNK-nyň soňunyň oligo (U) simden başlanýandygy kesgitlenildi (42, 43).Bu gözegçilik, otrisatel RNK sinteziniň nMP9 görnüşini UMPylated görnüşini poli (A) guýrugy (triggerler) bilen baglanyşdyrmak bilen başlaýandygy baradaky pikire laýyk gelýär, bu bolsa RNK-nyň işjeňligi we / ýa-da täsiri bilen ösdürilip bilner. başga bir RTC belogy.Nsp9 bilen üpjün edilen UMP bölegi, soňra genom RNK-daky 3 ?? poly-poli (A) guýrugyny ýa-da başga bir oligo (A) yzygiderli yzygiderliligini ulanyp, nsp7 / 8 / nsp12-töwekgelçilikli oligouridilasiýa üçin "başlangyç" hökmünde ulanylyp bilner. pikornawirus VPg belogy üçin döredilen mehanizme meňzeş şablon bolup hyzmat edýär (44).Teklip “kadaly däl” bolsa näme etmeli????(Belok bilen örtülen) otrisatel RNK sinteziniň başlangyjy, koronawirus negatiw zolakly RNK-nyň ahyrynda (42) UMP bardygyny görkezýär, bu bolsa görkezmek üçin hasaplanýar; nuklein kislotasy Diser näbelli peşew bilen baglanyşykly endonukleýz bilen fosforirlenen ahyrky fosforilaty ýapýar.Eger tassyklanylsa, bu nuklein kislotasynyň gidrolitiki işjeňligi, täze döreýän negatiw zolagyň 5 ² ujundan nsp9-nyň oligomer UMPylated görnüşini boşatmaga kömek edip biler.Beloklaryň emele gelmeginde nsp9-nyň ähtimal roly, öňki ters genetika gözleglerine-de laýyk gelýär, olar nsp9 (we nsp8) koronawirus geniniň 3 ujunda konserwasiýa edilen RNK elementi bilen tankydy we aýratyn täsirleşýändigini görkezdi.45).Hasabata görä, bu öňki synlamalar indi gaýtadan gözden geçirilip we has giňişleýin gözlegler arkaly giňeldilip bilner.
Gysgaça aýdanymyzda, maglumatlarymyz N-terminusda RdRp bilen baglanyşdyrylan öýjükli wirus ferment belliginiň aýratyn işjeňligini kesgitledi.Koronawirusda täze açylan NiRAN-töwellaçylykly UMPylator / NMPylator işjeňligi Mn2 + we ýanaşyk Asn galyndylaryna bil baglamak we N terminaly esasy amin bilen (pes energiýaly) fosforidat baglanyşyklarynyň döremegine sebäp bolýar.Nsp8 | 9 ýaryş meýdançasyndaky Mpro-töwellaçylyk arkaly, nsp9 nyşany NMPylation üçin ulanylyp bilner, bu bolsa proteaz bilen RdRp-e çenli uzalyp gidýän NiRAN domeniniň arasyndaky funksional baglanyşygy görkezýär.Nsp12 NiRAN işjeň ýerinde we nsp9 nyşanynda esasy galyndylary gorap saklamak, SARS-CoV-2 ýaly iki koronawirusdan alnan maglumatlar bilen bilelikde, nsp9 NMPylation-yň koronawirus Konserwatiw aýratynlyklarynyň wirusyň köpelmeginde möhüm ädimdigini görkezýär.Bar bolan maglumatlar, NMP9 görnüşli nsp9 görnüşiniň belok bilen örtülen RNK sintezinde koronawirus we beýleki höwürtgeleýän wiruslar üçin amatly ssenariýadyr we NiRAN beýleki näbelli beloklary hem nyşana alyp biler.Wirusy kadalaşdyryň.Hoster eýesi bilen özara täsir.Eger tassyklanylsa, wirus RNK sintezine belok primerleriniň gatnaşmagy, öň döredilen Pisonivirites (9) -da öň ýüze çykarylan koronawirus we pikornawirusa meňzeş topar (9) arasynda Mpro / 3CLpro we RdRp domenleriniň yzygiderliligini ýokarlandyrar (9). 46) kategoriýada.
Maglumatlarymyz, şeýle hem bu gözlegde kesgitlenen esasy, saýlama we konserwatiw ferment işleriniň wirusa garşy dermanlar üçin maksat hökmünde ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.NiRAN-yň işjeň ýerinde konserwirlenen nsp9 N-termininiň baglanmagyna (we soňraky üýtgemegine) päsgel berýän birleşmeler, dürli (aşaky) jyns ýokançlyklaryndan haýwan we adam koronawiruslaryny bejermek üçin täsirli we köpugurly wirusa garşy dermanlara öwrülip biler. , şol sanda SARS-CoV-2 we Eastakyn Gündogar dem alyş sindromy Coronavirus.
Bu gözlegde öndürilen koronawirus belogynyň kodlaşdyryş tertibi, HCoV-229E ýokaşan Huh-7 ýa-da SARS-CoV-2 ýokaşan Vero E6 izolirlenen RNK ulanyp, RT-PCR tarapyndan güýçlendirildi we adaty klonlaşdyryş proseduralary bilen girizildi.pMAL-c2 (Täze Angliýa biologiki barlaghanasy) ýa-da pASK3-Ub-CHis6 (47) aňlatma wektory (SI goşundy, S1 we S2 tablisalar).Codeeke kodon çalyşmalary PCR esasly saýta gönükdirilen mutagenez tarapyndan girizildi (48).MBP birleşme belogyny öndürmek üçin E. coli TB1 öýjükleri degişli pMAL-c2 plazmid konstruksiýasy bilen üýtgedildi (SI goşundy, S1 tablisa).Birleşýän belok amiloza ýakynlygy hromatografiýasy bilen arassalanyp, Xa faktor bilen ýapyldy.Netijede, C terminaly His6 bellikli belok, Ni-immobilizirlenen metal ýakynlygy hromatografiýasy (Ni-IMAC) bilen öň beýan edilişi ýaly arassalandy (49).“Ubiquitin” birleşdirme belogyny öndürmek üçin E. coli TB1 öýjükleri degişli pASK3-Ub-CHis6 plazmid konstruksiýasyny (SI Goşundy, Tablisa S1 we S2) we hemme ýerde ýerleşýän C terminaly gidrolaza 1 (Ubp1) kodlaýan pCGI plazmid DNK ulandy.Üýtgetme (47).C terminaly His6 bellikli koronawirus belogy öň beýan edilişi ýaly arassalandy (50).
HCoV-229E nsp12-His6-yň öz-özüni NMPilýasiýa synagy EAV nsp9 (16) -da görkezilişi ýaly geçirildi.Gysgaça aýdylanda, nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4- (2-gidroksietil) -1-piperazineetanesulfon kislotasy (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM diotiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM bufer, inkubat görkezilen NTP we 0.17 µM gabat gelýär [α32-P] NTP (3000 Ci / mmol; Hartmann Analitik) 30 ° C-de 30 minut.Nsp12-töwekgelçilikli nsp9 NMPylation-yň beýleki (standart) NMPylation barlaglarynda, reaksiýa şertleri aşakdaky ýaly düzülýär: nsp12-His6 (0.05 µM) we nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM NTP görkezdi, we 0,17 µM gabat geldi [α32-P] NTP.30 ° C-de 10 minut inkubasiýa edilenden soň, reaksiýa nusgasy SDS-PAGE nusga buferi bilen garyldy: 62,5 mM tris (gidroksimetil) aminometan HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% gliserol we 0,005% bromofenol gök.Belok 90 ° C-de 5 minut gyzdyryp, 12% SDS-PAGE bilen bölünip aýryldy.Jel “Coomassie Brilliant Blue” ergini (40% metanol, 10% sirke kislotasy, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) bilen reňklenýär we reňklenýär we 20 sagatlap fosforesent şekillendiriş ekranyna sezewar bolýar (NMPylation-dan nsp12-ni anyklamak üçin); ýa-da (iň ýokary) 2 sagat (nsp9 NMPylation-a baha bermek).Ekrany skanirlemek üçin Taýfun 9200 şekillendirijisi (GE Healthcare), signalyň intensiwligini seljermek üçin ImageJ ulanyldy.
MS derňewi üçin, NMPylation derňewinde (SI goşundy, S1 tablisa) 1 µM nsp12-His6 we 10 µM nsp9 (hexahistidin belligi bolmazdan) ulanyldy we 500 µM UTP we GTP konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy ulanyldy.Olaryň konsentrasiýasyna we garaşylýan belogyň hiline baglylykda, MassPrep sütüni (Waters) bilen enjamlaşdyrylan Waters ACQUITY H-Class HPLC ulgamy, buferli belok erginleriniň 1-den 10 µL-a çenli duzlanmagy üçin ulanyldy.Süýjedilen belok, Synapt G2Si köpçülik spektrometriniň (Suw) elektrospraý ion çeşmesine, bufer A (suw / 0.05% formik kislotasy) we B buferi (asetonitril / 0.045% formik kislota) arkaly bölünýär we sütüniň temperaturasy 60 ° C we akym tizligi 0,1 ml / min: 2 minutda 5% A bilen demokratiýa, soň bolsa 8 minutyň içinde çyzykly gradiýent 95% B, ýene 4 minut 95% B saklaň.
Massa 500-den 5000 m / z aralygyndaky oňyn ionlar tapyldy.Glu-fibrinopeptid B her 45 sekuntda awtomatiki köpçülikleýin süýşmegi düzetmek üçin ölçelýär.Esasy aýyrylandan we tekizlenenden soň ortaça spektri çözmek üçin MaxEnt1 giňeltmesi bilen MassLynx gural programma üpjünçiligini ulanyň.
UMPylated HCoV-229E nsp9 yzygiderli derejeli üýtgedilen tripsini (Serwa) goşmak bilen siňdirildi we bir gije 37 ° C-de inkubasiýa edildi.Peptidleri duzlamak we jemlemek üçin “Hromabond C18WP” aýlaw sütüni (bölek belgisi 730522; Maçeri-Nagel) ulanyldy.Ahyrynda, peptid 25 µL suwda eräp, düzüminde 5% asetonitril we 0,1% formik kislotasy bar.
Nusgalar MS tarapyndan Orbitrap Velos Pro köpçülik spektrometrini (Termo Scientific) ulanyp seljerildi.Iň soňky nanoâ HPLC ulgamy (Dionex), adaty gurnalan 50 sm bilen enjamlaşdyrylan ??2,4 μm magnitli monjuklar bilen gaplanan 75 μm C18 RP sütüni (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray çeşmesi arkaly onlaýn köpçülik spektrometrine birikdiriň;300 µm içki diametrine 6 µL tripsin siňdiriş erginini sanjym × ??1 sm C18 PepMap konsentrasiýadan öňki sütün (Termo ylmy).Suw / 0,05% formik kislotany çözüji hökmünde ulanyp, nusga awtomatiki usulda 6 µL / min akym tizliginde duzlandy.
Aşakdaky gradiýentler 300 nL / min akym tizliginde triptiki peptidleriň bölünmegini gazanmak üçin suwuň 0,05% formik kislotasy (çözüji A) we 80% asetonitril / 0.045% formik kislotasy (B çözüji) ulanyldy. 5 minut, soň 30 çyzykly gradiýent birnäçe minutyň içinde 45% B, çyzykly bolsa 5 minudyň içinde 95% çözüji B çenli ýokarlanýar.Hromatografiki sütüni poslamaýan polatdan nano-emitter (Proxeon) bilen birleşdiriň we 2300 V. potensialyny ulanyp, eluenti göni köpçülik spektrometriniň gyzdyrylan kapilýaryna pürküň, Orbitrap köpçülikleýin analizatorynda 60,000 durulykdaky gözleg skaneri bilen baglanyşyklydyr. azyndan üç maglumat MS / MS skaner bilen, 30 sekundyň dowamynda dinamiki taýdan çykarylýar, orbitrap kesgitlemesi bilen birleşdirilen çyzykly ion duzak çaknyşygynyň ýa-da has ýokary energiýa çaknyşygynyň bölünişini ulanyp, çözgüdi 7500.
Iş wagty: Awgust-03-2021